尊龙凯时所提供的Western Blot技术是一项广泛应用于生物医学领域的重要工具，其实验成功率受到多种因素的影响。以下13个关键技巧可以帮助提升Western Blot实验的成功率。

一、蛋白样本制备

根据样本类型和目标蛋白的性质，选择合适的蛋白提取方法。如果目标蛋白表达量较高，则使用总蛋白提取即可；反之，对于低表达量的目标蛋白，或需要分析细胞不同组分的表达量，则应进行细胞组分分离，以富集目标蛋白。务必尽量提取所有蛋白并降低杂质。对于难溶解的膜蛋白、核蛋白及难裂解的组织样品，如脂肪、骨骼、皮肤、血管等，可以选择尊龙凯时的专用试剂盒进行蛋白的富集。同时，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以防止蛋白的降解，而磷酸化蛋白的研究则需额外加入磷酸酶抑制剂。

二、样本定量分析

在上样之前，务必进行蛋白样本的精确定量。这不仅验证蛋白的有效提取，还可以确保样本浓度一致，从而实现等量上样，使条带更加美观，结果更具准确性和可信度。避免盲目点样，以防结果无法分析。

样品储存与处理

在完成蛋白定量后，充分混合样本与上样缓冲液后进行分装冻存。这有助于抑制磷酸酶和蛋白活性，降低在储存过程中质量变化的可能性。分装后的样品只需在下次实验前再加热变性即可快速使用，提高实验效率。

三、电泳条件的选择

根据目标蛋白的分子量，精准选择电泳凝胶浓度。合适的凝胶浓度能够提升蛋白条带的分辨率，避免条带模糊或扭曲。例如，对于小分子量蛋白，应选择较高浓度的凝胶；而对于大分子量蛋白，则需选用较低浓度的凝胶，以确保良好的分离效果。上样量应综合考虑目标蛋白的表达量与样品浓度，通常控制在15-70ug之间。如果目标蛋白含量较低，可以使用浓缩方法提升上样量，比如采用超滤离心管进行浓缩处理。

四、转膜条件的确定

转膜条件需要综合考虑蛋白的分子量和等电点。对于小分子量蛋白，可选择小孔径膜并缩短转移时间以提高转膜效率；而对于高分子量蛋白，则需延长转膜时间确保充分转移。在转膜过程中，务必确保凝胶与膜完全接触，避免气泡的形成。完成转膜后，可以通过染色法验证膜上蛋白的转移情况。

五、封闭与抗体孵育

常用的封闭液包括脱脂奶粉和牛血清白蛋白（BSA）。对于磷酸化蛋白的检测，建议使用5%的BSA进行封闭。抗体的稀释比例对Western Blot的成功至关重要，应根据实验结果进行调整。不要因为信号弱而盲目增加抗体量，以免引起高背景。

六、显色与曝光

根据实验需求选用合理的显色系统。化学发光（ECL）系统因其高灵敏度和便捷性成为常用的显色方法。在选择显色系统时，需考虑后续成像设备的匹配性，以确保能够清晰捕捉蛋白条带信号。曝光时间应根据显色系统的灵敏度与条带亮度灵活调整。

附赠锦囊：Western Blot实验常用试剂配方

以下是一些常用的实验配方：

1. 样品制备相关试剂：RIPA裂解液（改进版）

• 50mM Tris-HCl (pH7.4)
• 150mM NaCl
• 1% NP-40
• 0.5% sodium deoxycholate
• 0.1% SDS
• 1mM EDTA
• 1mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
• 1mM NaF（磷酸酶抑制剂，可选）
• 1mM Na3VO4（磷酸酶抑制剂，可选）

2. 凝胶制备相关试剂：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

• 分离胶（以10%胶为例）：
• 水：195ml
• 30% Acr：17ml
• 15M Tris-HCl-SDS (pH8.8)：13ml
• 10% APS：0.5ml
• TEMED：0.02ml
• 浓缩胶（以5%胶为例）：
• 水：274ml
• 30% Acr：6.7ml
• 15M Tris-HCl (pH6.8)：5ml
• 10% APS：0.04ml
• TEMED：0.04ml

3. 上样及电泳相关试剂：5X SDS上样缓冲液

• Tris-HCl (pH6.8)：125ml
• SDS：0.5g
• 甘油：25ml
• 溴酚蓝：25mg
• 去离子水：定容至5ml
• β-巯基乙醇：使用前加入0.25ml β-巯基乙醇（或0.5M DTT）

4. 转膜及孵育相关试剂：转膜缓冲液（湿转法）

• Glycine：290g
• Tris：580g
• SDS：0.37g
• 甲醇：200ml
• ddH₂O：定容至1L

对于生物医学研究者来说，掌握这些Western Blot技巧将有助于提高实验的成功率，确保实验数据的准确与可靠。