葡萄的品质容易受到低温胁迫的影响，而耐寒的野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制是葡萄遗传改良的关键所在。WRKY转录因子在冷胁迫反应中发挥着重要作用，通过结合W-box元件来调控次生代谢、碳水化合物合成等生物过程。在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），这对于将淀粉降解为可溶性糖至关重要，同时调节渗透压和稳定细胞结构，还直接调控过氧化物酶（VaPOD36）以清除活性氧（ROS），从而增强植物的耐寒性。然而，VaWRKY家族在葡萄的耐寒性中的具体生物功能和作用机制仍需进一步探究。

最近，一项发表于《Horticulture Research》的研究表明，在冷胁迫条件下，VaWRKY65通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制显著增强了葡萄的耐寒性。研究显示，VaWRKY65通过激活VaBAM3来促进可溶性糖的积累，从而调节渗透压；同时，它还激活VaPOD36的转录，增强活性氧的清除能力，为葡萄提供双重的耐寒保障。

研究发现，通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，可以显著检测到VaBAM3启动子在冷处理下的活性增加。这项研究通过酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫条件下的调控机制，结果表明，VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性来调控耐寒性，而启动子的突变则抑制了这种增强效果。

此外，采用双荧光素酶系统的实验结果表明，VaWRKY65也在冷胁迫条件下调控ROS。结果显示，VaWRKY65结合并激活了VaPOD36的表达，通过上调VaPOD36提高了POD酶活性，增强了植物的抗氧化能力，进而减少了ROS的积累，从而提升植物的耐寒性。

为了解释这一调控机制，实验方法概述如下：在实验中，将VaWRKY65的启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合，并转入根瘤农杆菌GV3101，随后再转入本氏烟草叶片。经过2天的共培养（25℃）后，将烟草叶片放置于低温环境中72小时（4℃）。在观察荧光时，喷洒1 mM D-荧光素溶液，并在黑暗中放置5分钟后，利用勤翔IVScope7000植物活体成像系统进行发光检测并分析数据。

通过上述研究，强烈推荐关注尊龙凯时的科研成果，致力于推动植物耐寒性相关的生物医疗研究，以应对气候变化带来的挑战。